體外受精

體外受精

體外受精(英語:External fertilization)是一種精子與卵子在雌性生物體外結合產生配子的一種受精方式。在這種受精形式下,精子可利用在水中運動的能力,遊向卵子並與其結合。行體外受精的生物包括許多魚類與兩棲類,以及部分的植物。
  • 中文名稱
    體外受精
  • 外文名稱
    In Vitro Fertilization
  • 自然界類別
    魚類與兩棲類
  • 又名
    external fertilization

基本介紹

體外受精(In Vitro Fertilization)或(external fertilization)是指哺乳動物的精子和卵子在體外人工控製的環境中完成受精過程的技術,英文簡稱為IVF。由于它與胚胎移植技術(ET)密不可分,又簡稱為IVF-ET。

在生物學中,把體外受精胚胎移植到母體後獲得的動物稱試管動物(test-tube animal)。這項技術成功于20世紀50年代,在最近20年發展迅速,現已日趨成熟而成為一項重要而常規的動物繁殖生物技術引。 

發展歷史

20世紀60年代初至20世紀80年代中期,人們以家兔、小鼠和大鼠等為實驗材料,進行了大量基礎研究,在精子獲能機理和獲能方法方面取得很大進展。精子由最初在同種或異種雌性生殖道孵育獲能,發展到用子宮液、卵泡液、子宮內膜提取液或血清等在體外培養獲能,最後用化學成分明確的溶液培養獲能。同時,通過射出精子和附睾精子獲能效果的比較研究,人們發現射出精液中含有去能因子,並認識到獲能的實質是去除精子表面的去能因子。這些理論和方法上的成就,推動了體外受精技術的發展,試管小鼠(Whit-tingham,1968)、大鼠(Toyoda和Chang,1974)、嬰兒(Steptoe和Edwards,1978)、(Brackett等,1982)、山羊(Hamda,1985)、綿羊(Hanada,1985)和豬(Chang等,1986)等相繼出生。

體外受精

ⅣF技術

20世紀80年代中期以後,以牛為代表的家畜ⅣF技術發展迅速,1987年Parrish等用含肝素的介質處理牛的冷凍精液,然後與體外成熟的卵母細胞體外受精獲得成功。這對牛ⅣF的研究和套用具有重要意義,因為這種方法可利用屠宰場廢棄的卵巢和冷凍精液進行胚胎體外生產,不僅成本低廉,而且效果穩定。此後,牛的卵母細胞體外成熟和胚胎培養體系逐步趨于成熟,胚胎體外生產效率得到很大提高。目前,採用ⅣF_ET技術,每對廢棄的牛卵巢可獲得3頭左右的犢牛。為充分利用良種母牛的遺傳資源,20世紀80年代後期,牛的活體取卵技術(Ovum pick UP.OPU)發展迅速。活體取卵和ⅣF_ET結合已成為歐、美和大洋洲等畜牧業發達國家的農場主為擴大良種母牛群選擇的重要繁殖技術。

技術套用

牛的體外受精技術不僅套用于畜牧生產,同時,也成為研究其他胚胎生物技術,如克隆、轉基因、胚胎幹細胞分離培養和性別控製等的重要輔助手段。

不孕不育

在不孕症治療中,體外受精技術是與胚胎移植技術相關聯的。就是說當受精卵在人工孵育的條件下經過分裂,達到8至16個卵裂細胞時,再用人工方法移入分泌期的婦女子宮內,使孕卵著床。體外受精和胚胎移植技術的結合,就是人們通俗說的“試管嬰兒”技術,隨著科學的發展,這一技術在不孕症治療中將發揮更大作用。

操作程式

1.卵母細胞的採集:卵母細胞的採集方法通常有三種。

⑴超數排卵:對于實驗動物如小鼠、兔,以及家畜豬、羊等採用的主要方法是;用促性腺激素處理,使其排出更多的卵子,然後,從輸卵管中沖取成熟卵子可直接與獲能精子受精。在大家畜中,由于操作程式復雜,成本較高,很少使用。這種方法的關鍵是掌握卵子進入輸卵管和卵子在輸卵管中維持受精能力的時間,一般要求在卵子具有旺盛受精力之前沖取。

⑵從活體卵巢中採集卵母細胞 :這種方法是借助超音波探測儀、內窺鏡或腹腔鏡直接從活體動物的卵巢中吸取卵母細胞。

在家畜中, 牛和馬等大家畜常用超音波探測儀輔助取卵,其方法是用手從直腸把握卵巢,經陰道壁穿刺插入吸卵針,借助B型超音波圖像引導,吸取大卵泡中的卵母細胞。按照目前的技術水準,一頭健康母牛每周可獲得5~10枚卵子。在家畜中,活體採集的卵母細胞一般要經成熟培養後才能與精子受精。這種方法對擴繁優良母畜具有重大意義,在有些國家已用于商業化生產。

⑶從屠宰後母畜卵巢上採集卵母細胞:這種方法是從剛屠宰母畜體內摘出卵巢,經洗滌、保溫(30℃~37℃)後,快速運到實驗室,在無菌條件下用註射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直徑卵泡中的卵母細胞(牛卵泡直徑要求3-10mm)也可對卵巢進行切片,收集卵母細胞。用此方法獲得的卵母細胞多數處于生發泡期(GV期),需要在體外培養成熟後才能與精子受精。從廢棄卵巢中採集卵母細胞的關鍵是註意卵巢的保溫和防止細菌污染。因此卵巢從畜體摘取後須放入含有生理鹽水或磷酸緩沖液(PBS)的保溫瓶中;吸卵前卵巢要用生理鹽水或PBS多次洗滌;所用溶液都要增加抗生素。

這種方法的最大優點是材料來源豐富,成本低廉,但確定母畜的系譜困難。

2.母細胞的選擇:採集的卵母細胞絕大部分與卵丘細胞形成卵丘卵母細胞復合體(cumulus oocyte complesx COC)。無論採用何種方法,採集的COC都要求卵母細胞形態規則,細胞質均勻,外圍有多層卵丘細胞緊密包圍。在家畜體外受精研究中,常把未成熟卵母細胞分為A、B、C和D四個等級。A級卵母細胞要求有三層以上卵丘細胞緊密包圍,細胞質均勻;B級要求卵母細胞質均勻,卵丘細胞層低于三層或部分包圍卵母細胞;C級為沒有卵丘細胞包圍的裸露卵母細胞;D級是死亡或退化的卵母細胞。在體外受精實踐中,一般隻培養A級和B級卵母細胞。

3.卵母細胞的成熟培養:由超數排卵採集的卵母細胞已在體內發育成熟,不需培養可直接與精子受精,對未成熟卵母細胞需要在體外培養成熟。培養時,先將採集的卵母細胞在實體顯微鏡經過挑選和洗滌後,然後放入成熟培養液中培養。家畜卵母細胞的成熟培養液目前普遍採用TCM199增加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。通常採用微滴培養法,微滴體積為50-200微升,每滴中放入的卵母細胞數按每5微升一個計算單位。卵母細胞移入小滴後,放入二氧化碳培養箱中培養,培養條件為39℃、100%濕度和5%二氧化碳的空氣。牛的培養時間為20-24小時,卵丘卵母細胞復合體經成熟培養後,卵丘細胞層擴散靠近卵母細胞周圍的卵丘細胞呈放射狀排列,出現放射冠,用DNA特意性染料染色後,在顯微鏡下進行核相觀察,可見卵母細胞處于第2次成熟分裂中期。體外受精

1.精子的獲能處理:哺乳動物精子的獲能方法有培養和化學誘導兩種方法。牛、羊的精子常用化學葯物誘導獲能,誘導獲能的葯物常用肝素和鈣離子載體。

2.受精:即獲能精子與成熟卵子的共培養,除鈣離子載體誘導獲能外,精子和卵子一般在獲能液中完成受精過程。受精培養時間與獲能方法有關。在B2液中一般為6-8小時而用TALP或S.F液作受精液時可培養18~24h。精子和卵子常在小滴中共培養,受精時精子密度為1~9×10 6/ml,每10微升精液中放人1~2枚卵子,小滴體積一般為50~200微升。

胚胎培養

精子和卵子受精後,受精卵需移入發育培養液中繼續培養以檢查受精狀況和受精卵的發育潛力,質量較好的胚胎可移入受體母畜的生殖道內繼續發育成熟或進行冷凍儲存。

提高受精卵發育率的關鍵因素是選擇理想的培養體系。在家畜中,胚胎培養液分為復雜的和化學成分明確的培養液兩大類。復雜培養液中的成分很多,除無機和有機鹽外,還增加維生素、氨基酸、核苷酸和嘌呤等營養成分和血清,最常用的有TCM199、B2和F10。用它們培養胚胎時,可以採用體細胞共培養體系,即體細胞與胚胎在微滴中共同培養,利用體細胞生長過程中分泌的有益因子,促進胚胎發育,克服發育阻斷。

受精卵的培養廣泛採用微滴法,胚胎與培養液的比例為一枚胚胎用3~10微升培養液;一般5~10枚胚胎放在一個小滴中培養以利用胚胎在生長過程中分泌的活性因子,相互促進發育。胚胎培養條件與卵母細胞成熟培養條件相同。有的實驗室採用88% N2、7% O2和5%二氧化碳混合氣體培養,以降低培養液中氧自由基濃度,提高胚胎發育率。胚胎在培養過程中要求每48-72小時更換一次培養液,同時觀察胚胎的發育狀況。當胚胎發育到一定階段時可進行胚胎移植或冷凍儲存,牛、羊受精卵通常培養到致密桑椹胚或囊胚時進行移植或冷凍儲存。

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