耐甲氧西林金黃色葡萄球菌

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌是臨床上常見的毒性較強的細菌,自從上世紀40年代青酶素問世後,金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病受到較大的控製,但隨著青酶素的廣泛使用,有些金黃色葡萄球菌產生青酶素酶,能水解β-內酰胺環,表現為對青酶素的耐葯。科學家研究出一種新的能耐青酶素酶的半合成青酶素,即甲氧西林(methicillin)。1959年套用于臨床後曾有效地控製了金黃色葡萄球菌產酶株的感染,可英國的Jevons就首次發現了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA),MRSA從發現至今感染幾乎遍及全球,已成為院內和社區感染的重要病原菌之一。

  • 西醫學名
    耐甲氧西林金黃色葡萄球菌
  • 英文名稱
    Methicillin-resistant Stphylococcus aureus
  • 其他名稱
    MRSA
  • 傳染性
    有傳染性
  • 特徵
    不均一耐葯性、不均一耐葯性
  • 首次發現
    英國的Jevons
  • 耐葯機理
    固有耐葯、獲得性耐葯

特徵

不均一耐葯性

MRSA菌落內細菌存在敏感和耐葯兩個亞群,即一株MRSA中隻有一小部分細菌約10-4~10-7,對甲氧西林高度耐葯,在50 μg/ml甲氧西林條件下尚能生存,而菌落中大多數細菌對甲氧西林敏感,在使用抗生素後的幾小時內大量敏感菌被殺死,但少數耐葯菌株卻緩慢生長,在數小時反又迅速增殖。

廣譜耐葯性

MRSA除對甲氧西林耐葯外,對其它所有與甲氧西林相同結構的β-內酰胺類和頭孢類抗生素均耐葯,MRSA還可通過改變抗生素作用靶位,產生修飾酶,降低膜通透性產生大量PABA等不同機製[3],對氨基糖苷類、大環內酯類、四環素類、氟喹喏酮類、磺胺類、利福平均產生不同程度的耐葯,唯對萬古酶素敏感。

生長特殊性

MRSA生長緩慢,在30°C,培養基pH 7.0及高滲(40 g/L NaCl溶液)條件下生長較快[4]。在30°C時,不均一耐葯株表現為均一耐葯和高度耐葯,在37°C又恢復不均一耐葯。均一耐葯株在>37°C或pH<5.2時,均一耐葯性可被抑製而表現為敏感。增加NaCl濃度,低溫孵育和延長時間,可使不均一耐葯株群體中敏感亞群中的耐葯性得到充分表達,即能耐受較高濃度的甲氧西林,而對其中耐葯亞群無影響[5]。但最近也有報道,高滲下延長培養時間,會影響MRSA的檢出結果,因為在高鹽情況下,培養48 h,對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(methicillin sensitive Staphylococcus aureus;MSSA)易產生大量β-內酰胺酶,可緩慢水解甲氧西林,導致細菌生長,而誤認為MRSA。所以一般MRSA在高鹽環境孵育24 h,而耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)由于耐葯亞群菌數少于金葡菌,應孵育48小時觀察結果。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌

耐葯機理

固有耐葯

是由染色體介導的耐葯,其耐葯性的產生與細菌產生一種青酶素結合蛋白(PBP)有關。產生五種PBP(1,2,3,3′和4),它們具有合成細菌細胞壁的功能。它們與β-內酰胺類抗生素有很高的親和力,能共價結合于β-內酰胺類葯物的活動位點上,失去其活性導致細菌死亡,而MRSA產生了一種獨特的PBP,這種分子量增加了78~1000道爾頓的PBP,因其電泳率介于PBP2與PBP3之間,故稱為PBP2a或PBP2′[6]。PBP2a對β-內酰胺類抗生素親和力很低,因而很少或不被β-內酰胺類葯結合。在β-內酰胺類抗生素存在的情況下,細菌仍能生長,表現出耐葯性。PBP2a的產生是受染色體甲氧西林耐葯基因(mec A)來調節的。MRSA與MSSA根本區別在于它們的PBP不同。

獲得性耐葯

是質粒介導的耐葯。某些菌株通過耐葯因子產生大量β-內酰胺酶,使耐酶青酶素緩慢失活,表現出耐葯性[7],多為臨界耐葯。

分型

MRSA分型對追蹤傳染源、研究型別與感染種類和耐葯性的關系有重要意義。國外開展較早的有噬菌體分型:將待測菌于肉湯中,35°C孵育6 h,塗布于分型瓊脂平板上,待幹後將23種噬菌體註入瓊脂平板中的小方格內,再置35°C培養箱孵育,6 h後移至室溫過夜觀察結果。用4組23種噬菌體,將MRSA分為4群,一般以Ⅰ群為最多[8],也有報告以Ⅲ群為多。噬菌體分型結果常不滿意,日本小粟 子證實有29.3%菌株不能分型,且重復性差,不宜用于流行病學調查。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌

質粒圖譜分型較為可靠,可分為18個型,能準確地分析菌株之間的相關性,將流行菌株與非流行菌株加以區別。國內MRSA廣泛存在分子量為1.6 Md、1.8 Md及2.67 Md的質粒,不同地區和不同醫院會有特殊質粒帶。

免疫印跡分型法將MRSA分為9個型,以B、C型為最常見,各型含有特征性的分子帶,該法比較穩定。

染色體限製性內切酶分析可識別病原體DNA鏈上特異位點及核苷酸序列,能從基因水準顯示病原體特征。

MRSA還可用血清學、凝固酶、耐葯譜等方法分型。現在Southern印跡法也逐漸運用于MRSA的分型。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌

​檢測

由于MRSA的不均一耐葯性,給其檢測帶來一定的困難。MRSA的檢出率受孵育溫度、時間、培養基的pH和NaCl的濃度、菌液的數量等多種因素的影響。因此,目前還沒有一種最佳的檢測方法。

紙片擴散法(K-B法)

平皿中MH瓊脂厚度為4 mm,菌液調至0.5麥氏濁度,塗沫于上述平板,甲氧西林含量5 μg/片,35°C孵育24 h,抑菌圈≤11 mm為耐葯,≥17 mm為敏感,由于MRSA通常對其它耐酶半合成青酶素也耐葯,因此美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)推薦用苯唑西林來代替檢測MRSA。苯唑西林在貯存過程中葯效不易降低,且對不均一耐葯性檢測效果更好,所以國內多數實驗室都採用苯唑西林,苯唑西林含量為1 μg/片,抑菌圈≤10 mm為耐葯,≥13 mm為敏感,11~12 mm為中介。質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 29213(耐葯菌株),金黃色葡萄球菌ATCC 25923(敏感菌株)。紙片擴散法最大優點是快速、簡便、價格便宜,易被檢驗人員接受。在合適的抗生素及培養溫度、菌液的濃度、培養基厚度等條件下,檢測MRSA是可行的。但Leneastre等[9]對K-B法和特異性mec A基因DNA片段法鑒定MRSA的結果進行了比較,發現在49株用K-B法鑒定為MSSA的菌株,特異性mec A基因DNA片段法鑒定卻有11株含mec A基因;59株用紙片法鑒定為典型MRSA的菌株,有10株卻沒有特異性mec A基因,這兩種方法大約有18%~20%的差異。Chipman[10]等研究也表明以mec A基因檢測法為參考方法時,紙片擴散法的符合率為88.2%。這可能與紙片法中的瓊脂中沒有NaCl成份,一些菌株的耐葯性得不到完全表達有關。因此,為提高紙片擴散法檢測MRSA的可靠性,最好在MH瓊脂中加入40 g/L NaCl。

肉湯稀釋(MIC)法

美國疾病控製中心(CDC)推薦用MH肉湯培養基加NaCl至20 g/L濃度,同時加入Ca,Mg離子,將苯唑西林進行倍比稀釋,從0.125~16 μg/ml,菌濃度為104/ml,35°C孵育24 h,MIC<2 μg/ml為敏感,>4 μg/ml為耐葯,該法檢出率可達95%,但操作較繁瑣。

瓊脂稀釋(MIC)法

用含20 g/L NaCl的MH瓊脂將苯唑西林倍比稀釋為12個不同濃度並澆註平皿。苯唑西林量終濃度為0.125~256 μg/ml。再將菌液(0.5麥氏濁度)點種于含葯平皿,35°C孵育24 h。該法適用于大量菌株的MRSA檢測,結果容易判斷,重復性好,但耗時,費力。

瓊脂篩選法

這是1997年NCCLS推薦的MRSA的確證試驗,即MH培養基加NaCl(40 g/L)加苯唑西林(6 μg/ml),將菌液(0.5麥氏濁度)點種或畫線35°C孵育24 h,隻要平皿有菌生長,即使一個菌落也是MRSA,該法敏感度為100%,常用作校正其它方法的標準,尤其適用于檢測抑菌圈直徑處于中介度的金黃色葡萄球菌。

濃度梯度(Etest)法

是1988年AB Biodisk公司推出,在含20 g/L NaCl的MH瓊脂平板上,貼上苯唑西林的試條,菌液調至0.5~1麥氏濁度,35°C孵育24 h,直接讀取MIC值。MIC<2 μg/ml為敏感,>4 μg/ml為耐葯。Etest法結合了紙片擴散法和肉湯稀釋法的優點,長塑膠條含有連續的呈指數梯度變化的苯唑西林(0.016~256 μg/ml),故在檢測低水準或中等程度耐葯的MRSA時結果更為準確。Novak[11]等報道,用Alamar法和Etest法對127株MRSA的檢測比較,兩者結果相關較高,用Etest法檢測127株MRSA,其中93株MIC>256 μg/ml,28株在6~256 μg/ml,檢出率達96%,Etest法具有精確、可靠、穩定性好的特點,但缺點是價格昂貴。

自動化葯敏檢測

目前有Phoenix系統、Vitek系統、ATB系統、MicroScan系統、Sensiter ARIS等。將菌液稀釋後註入葯敏板或孔內,然後通過檢測菌液濁度,熒光指示劑的熒光強度或熒光底物的水解反應來判讀結果。其優點是快速,但有時對生長緩慢或延遲表達耐葯性的MRSA,在3~4 h內難以達到檢測水準,容易漏檢或誤報MRSA。

DNA探針雜交

上述的方法都是檢測MRSA耐葯表型的方法。MRSA根據其耐葯頻率可分為1、2、3、4類,其耐葯頻率為10-7、10-4、10-3以及10-1[12]。上述常規的檢測方法對于3、4類MRSA一般不存在問題,但對于低頻率的1、2類則很容易造成漏檢。因此,對于低水準耐葯或臨界水準耐葯的MRSA,應選擇特異性高的分子生物學方法來檢測。DNA探針雜交是用特異性的mec A DNA片段經地高辛標記,與可疑菌株進行雜交,有學者報告[13],DNA探針僅與MRSA DNA雜交,與MSSA DNA無雜交帶,其特異性高于瓊脂稀釋法,敏感性高于肉湯稀釋法,而且可直接用于臨床標本,無需先進行細菌分離培養,但探針較貴,儲存期較短。

PCR技術

本世紀80年代末期,國外就有人用聚合酶鏈反應(PCR)來檢測PBP2a的mec A基因。它是根據金黃色葡萄球菌TK 784的mec A基因DNA序列[14]設計一引物,再裂解提取被測菌的DNA,在一定條件下進行擴增,經瓊脂糖電泳後在紫外燈下觀察有無與陽性對照菌株(金黃色葡萄球菌ATCC29213)相同的區帶。PCR具有較高的靈敏度,隻要被測菌有微量的的基因,即出現陽性結果,因此常作為檢測MRSA的參考方法。陳秀樞實驗表明[14],金黃色葡萄球菌耐苯唑西林的耐葯水準與mec A基因有較好的相關性。MIC>4 μg/ml的22株菌均檢出mec A基因。由于PCR很靈敏,有時會因實驗室的污染而出現假陽性,為使PCR具有更高的可靠性,必須對其擴增產物進行探針雜交或測序以提高特異性[15]。而有一些耐葯基因是沉默基因,不表達mec A基因產物,有時會得出假耐葯結論,所以分子生物學方法並非100%的敏感和特異,加上該法前期處理操作繁瑣,且需要一定的設備,僅在可疑或特殊情況下做此試驗。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染的流行概況

自從1961年英國發現MRSA後,在歐美及亞洲一些國家相繼報道了MRSA所致的院內感染。從60年代後期到80年代,MRSA感染率大大增加。美國NNIS報道1975年182所醫院MRSA佔金黃色葡萄球菌感染總數的2.4%,1991年上升至24.8%,其中尤以500張床以上的教學醫院和中心醫院為多,因為這些醫院裏MRSA感染的機會較多,耐葯菌株既可由感染病人帶入醫院,也可因濫用抗生素在醫院內產生[16]。歐洲1993年1417家醫院ICU分離的MRSA達60%[17]。而日本Kansai醫科大學附屬醫院MRSA的分離率1993年達到41%。國內在70年代發現有MRSA,近幾年MRSA的檢出率正在逐年上升,上海1978年在200株金黃色葡萄球菌中MRSA隻佔5%,1988年上升至24%,1996年激增至72%[18]。天津1988年調查MRSA分離率為47%[19],北京醫科大學附屬醫院1996年分離MRSA達58.3%[20],山東淮坊市1996年在三家醫院的嬰兒室分離出金黃色葡萄球菌198株,其中MRSA為112株(56.5%)[21]。武漢同濟醫科大學附院1992年分離MRSA就達79.6%[22]。MRSA感染多發生于免疫缺陷者,大面積燒傷,大手術後患者,長期住院及老年患者,MRSA極易導致感染的流行和暴發。MRSA傳播主要通過醫護人員的手,在患者、醫護人員、患者間播散,另外,衣物、敷料等物品可攜帶MRSA,促進MRSA在院內的流行,病人一旦感染或攜帶MRSA,該菌可存在于患者身上達數月之久。

治療和預防

MRSA的治療

MRSA感染的治療是臨床十分棘手的難題之一,關鍵是其對許多抗生素有多重耐葯。因其耐葯機製是PBPs(青酶素結合蛋白)性質的改變,因此,MRSA幾乎對所有的β-內酰胺類抗生素耐葯,且在同時,還可能對大環內酯類抗生素、氨基糖苷類抗生素等多種抗菌葯物表現出耐葯性。目前最常用,也是療效最肯定的抗生素為萬古酶素、去甲萬古酶素、替考拉寧等。其次,對于以上葯物有禁忌症,或是不可耐受的患者,也可使用其他的抗菌葯物,如夫西地酸鈉。而在某些國家和地區,也可使用頭孢吡普、替加環素、利奈唑胺達托酶素等,均有較好的療效。

MRSA預防

首先是合理使用抗生素。目前臨床濫用抗生素的現象,對MRSA的流行起了一定的擴散作用,因此,在選擇抗生素時應慎重,以免產生MRSA菌株,如對大手術後預防深部葡萄球菌感染,使用第一代和第二代頭孢菌素為好(如頭孢唑啉、頭孢呋肟等),第三代頭孢菌素抗葡萄球菌效果反而不如第一代效果好。第三代頭孢菌素的長期使用與MRSA的出現率呈平行關系。

早期檢出帶菌者

醫院應加強對新入院及MRSA易感者的檢查,尤其是燒傷病區、ICU、呼吸病房、血液科和小兒科的病人。同時細菌室應選用準確的檢測手段,發現MRSA,及時向臨床報告,以便控製感染和隔離治療。

加強消毒製度

醫護人員檢查病人前後要嚴格洗手消毒,有條件套用一次性口罩、帽子、手套,醫療用品要固定,以防院內交叉感染。

超級細菌

2015年,廣州捷運系統檢出超級細菌--耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)。感染超級細菌雖然比較危險,但不用恐慌。正常人如果手上沒有傷口,而且勤洗手,不用擔心感染。超級細菌對免疫力較差的人威脅比較大,從傳染病防控角度來看,捷運是可能是超級細菌和其他耐葯菌的傳染源之一,應該進行更嚴格感染控製和監控措施,比如加強消毒,乘客也應註意個人衛生防護。

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